Un nouveau système pour induire des cellules épithéliales alvéolaires et respiratoires

Un nouveau système pour induire des cellules épithéliales alvéolaires et respiratoires

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Le professeur Shimpei Gotoh et le professeur agrégé Kazuo Takayama se sont associés dans une étude visant à construire un nouveau système de culture in vitro pour les cellules épithéliales des alvéoles et des voies respiratoires, en utilisant une méthode d'ingénierie des biomatériaux connue sous le nom de technique de micro-structuration et en utilisant le système nouvellement conçu pour simuler des infections virales. par les variantes du SRAS-CoV-2. L'étude est publiée dans la revue Rapports sur les cellules souches.

L'épithélium respiratoire tapissant les voies respiratoires et les alvéoles, où se produisent les échanges d'oxygène et de dioxyde de carbone, se compose principalement de deux types de cellules, les cellules épithéliales alvéolaires de type 1 et 2, appelées respectivement AT1 et AT2. Alors que les cellules AT1 sont minces et plates, optimales pour la médiation des échanges gazeux, les cellules AT2 cuboïdes sécrètent des protéines tensioactives et agissent comme des cellules souches tissulaires.

Grâce à leurs capacités d’auto-renouvellement et de différenciation AT1, les cellules AT2 présentent un intérêt particulier en médecine régénérative pour faciliter la réparation des poumons blessés ou malades. Le laboratoire Gotoh a déjà conçu un protocole pour utiliser les cellules iPS comme matière première précieuse pour générer des cellules AT2.

Cependant, l’exigence d’une culture 3D basée sur Matrigel limite la taille de la culture et l’analyse directe basée sur l’image. De plus, les cellules de tels systèmes s’orientent généralement avec leur surface apicale tournée vers l’intérieur, ce qui les rend incapables de modéliser avec précision la structure tissulaire in vivo pour les études mécanistiques.

Dans le but de créer un meilleur moyen de différencier et de cultiver des cellules AT2 dérivées de cellules iPS, des plaques de culture cellulaire non adhésives à 2,5 dimensions (D) ont été micro-structurées avec de minuscules cercles de revêtement adhésif cellulaire, de 100 ou 200 μm de diamètre. (à titre de comparaison, le diamètre des cheveux humains varie de 17 à 181 μm).

Premièrement, pour garantir que ces plaques à micro-motifs sont compatibles avec l'induction de cellules AT2, des cellules progénitrices pulmonaires dérivées de cellules iPS qui expriment une protéine fluorescente verte lors de la différenciation en cellules AT2 ont été ensemencées et traitées avec un milieu de culture spécifiquement pour l'induction de cellules épithéliales alvéolaires.

Par rapport aux cultures monocouches 2D conventionnelles, la proportion relative de cellules fluorescentes et l'expression de SFTPC, un gène codant pour l'une des nombreuses protéines tensioactives, étaient significativement plus élevées dans le système à micro-motifs que dans les cultures conventionnelles. Notamment, la protéine NaPi2b a été observée au bord des colonies formées sur le revêtement adhésif cellulaire à micro-motifs, ce qui indique une orientation « apicale vers l'extérieur » pour ces cellules AT2.

Au cours de cette étude, les chercheurs ont observé qu'un colorant fluorescent se liant à l'ADN (Hoechst-33342) colorait les cellules vivantes périphériques beaucoup plus rapidement que celles du centre. En séparant les cellules en fonction de leur intensité de fluorescence, ils ont découvert que davantage de cellules présentant une fluorescence verte et des gènes marqueurs AT2 étaient enrichies dans la sous-population de bord (Hoechst-33342high) par rapport à la sous-population centrale (Hoechst-33342low), indiquant en outre que les cellules AT2 étaient sur la périphérie.

L’équipe de recherche a ensuite séparé les cellules marginales et centrales et analysé leurs profils d’expression génique par séquençage en masse d’ARN (RNA-seq). Parmi près de 2 000 gènes différentiellement exprimés, plusieurs gènes marqueurs AT2 et gènes suppresseurs endogènes du WNT étaient significativement régulés positivement dans la sous-population périphérique par rapport aux cellules progénitrices pulmonaires indifférenciées, ce qui indique une suppression de la signalisation WNT dans les cellules AT2 à la périphérie. En revanche, le profil d’expression génique suggérait une activation de la signalisation Notch dans la sous-population principale.

Ensuite, pour démontrer que ce système à micro-motifs peut générer des cellules épithéliales multiciliées des voies respiratoires, les cellules progénitrices pulmonaires ont été traitées avec un milieu favorisant la différenciation vers un épithélium mature des voies respiratoires. En conséquence, l’expression génique, l’immunofluorescence et les analyses au microscope électronique ont détecté la régulation positive des gènes marqueurs des cellules multiciliées (FOXJ1 et SNTN) et des protéines (FOXJ1 et tubuline acétylée), ainsi que le déplacement des cils dans les cellules multiciliées.

De plus, le système à micro-motifs était plus efficace pour générer des cellules FOXJ1+ que les cultures 2D conventionnelles. Par séquençage d'ARN en masse, les chercheurs ont discerné que les gènes liés aux lignées de cellules caliciformes et muqueuses étaient de la même manière régulés positivement dans les sous-populations marginales et centrales par rapport aux cellules progénitrices du poumon, la sous-population centrale montrant également une régulation positive de plusieurs gènes marqueurs associés aux cellules multiciliées, en plus d'un enrichissement de plusieurs termes d'ontologie génétique (GO) avec ses gènes différentiellement régulés positivement.

Les chercheurs ont également analysé les différents types de cellules dans les colonies à micro-motifs par l'ARN-seq unicellulaire (sc) induit dans les deux types de cellules épithéliales. Les cellules épithéliales alvéolaires étaient principalement séparées en trois groupes : les cellules AT2 caractérisées par une expression élevée de gènes marqueurs AT2, les cellules AT2 en prolifération avec une faible expression de marqueur et les cellules ressemblant à des bronchioles respiratoires.

À l’inverse, un cluster multicilié exprimant SNTN et FOXJ1 et plusieurs clusters représentant des cellules épithéliales ciliées relativement immatures (FOXJ1, DRC1 et CCNO) ou des cellules sécrétoires immatures (SERPINA1 et MUC5B) ont été identifiés dans les cellules épithéliales des voies respiratoires. Fait intéressant, un groupe indépendant formé de cellules en périphérie présentait des changements transcriptomiques ressemblant à des cellules précédemment décrites comme cellules intermédiaires sur la trajectoire de différenciation des cellules AT2 aux cellules AT1.

L'équipe de recherche a ensuite infecté les cultures épithéliales alvéolaires ou respiratoires à micro-motifs avec cinq variantes du SRAS-CoV-2, B.1.1.214, B.1.617.2 (delta) et les variantes omicrons BA.1, BA.2 et BA.5, pour examiner la faisabilité d'utiliser ce nouveau système pour étudier les infections par des virus respiratoires.

Notamment, alors que les cellules épithéliales alvéolaires infectées par les variantes B.1.1.214 et B.1.617.2 libèrent facilement des virus, les infections par les variantes omicron entraînent une libération virale beaucoup plus faible. Les cellules épithéliales des voies respiratoires infectées par B.1.1.214-, B.1.617.2- et BA.5 ont suivi une tendance similaire, libérant de la même manière de grandes quantités de virus trois jours après l'infection (dpi), mais ont diminué de manière significative quatre dpi après infection par B.1.617.2 ou BA.5. En revanche, les cellules épithéliales des voies respiratoires infectées par BA.1 et BA.2 ont libéré des niveaux négligeables de virus.

De même, lorsque l’expression des gènes viraux a été examinée, B.1.617.2 a montré un tropisme viral élevé, car les deux types de cellules épithéliales ont montré des augmentations spectaculaires de l’expression des gènes viraux et des niveaux de protéines. Notamment, B.1.1.214 et BA.1 ont montré une spécificité faible et forte pour les cellules épithéliales alvéolaires et respiratoires, respectivement, car l'expression des gènes viraux et les niveaux de protéines dans les cellules épithéliales spécifiées étaient plus élevés que les autres.

Enfin, l’équipe de recherche a examiné les profils d’expression génique des cellules épithéliales alvéolaires et des voies respiratoires dus à l’infection par B.1.617.2 et BA.1. Alors que les cellules épithéliales des alvéoles et des voies respiratoires infectées par B.1.617.2 et les cellules épithéliales des voies respiratoires infectées par BA.1 ont toutes montré une réponse à l'interféron, les cellules épithéliales des voies respiratoires infectées par B.1.617.2 ont subi des changements d'expression génique indiquant l'apoptose (mort cellulaire programmée) , ce qui a été confirmé par des tests indépendants.

À l’aide de ce système de culture à micro-motifs, l’équipe de recherche a réussi à créer un moyen de cultiver des cellules AT2 dans la bonne orientation (avec leur surface apicale face au milieu) qui soit modifiable en imagerie.

Les chercheurs ont également démontré l'applicabilité des cellules épithéliales alvéolaires et des voies respiratoires induites dans le système à micro-motifs pour révéler des caractéristiques virales spécifiques aux variantes telles que le tropisme viral, une propriété qui rend le système adaptable à la modélisation de maladies et à la découverte de médicaments.

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