Un nouvel outil élargit les horizons du séquençage des neurones

Depuis que le neuroanatomiste Santiago Ramón y Cajal a découvert les neurones merveilleusement complexes du cerveau – ce qu’il appelait « les mystérieux papillons de l’âme » – les neuroscientifiques ont cherché à caractériser les centaines ou les milliers de variétés de cellules cérébrales et à révéler leur fonctionnement. ensemble. Il s’agit d’un objectif ambitieux, mais qui aiderait grandement les neuroscientifiques à comprendre enfin le réseau complexe des circuits cérébraux et leur fonction.

Au cours de la dernière décennie, ce domaine a reçu un élan bienvenu grâce aux nouvelles technologies transcriptomiques unicellulaires, qui identifient les neurones et d’autres cellules cérébrales en mesurant les différences dans les modèles d’expression des gènes. Une famille de techniques appelées transcriptomiques spatiales a franchi une étape cruciale plus loin, en informant les chercheurs non seulement sur l’identité et la fonction d’une cellule, mais également sur la manière dont elle s’intègre dans le câblage complexe du cerveau.

Mais la transcriptomique spatiale rencontre un problème persistant. De nombreux types de cellules différents sont souvent de proches voisins dans le cerveau, se mélangeant et partageant rapidement des messages les uns avec les autres. Cela signifie que les méthodes actuelles de transcriptomique spatiale n’ont pas une résolution suffisamment bonne pour éviter de mélanger les gènes des cellules voisines et d’identifier incorrectement les types de cellules.

Maintenant, dans un article publié le 22 juin dans Méthodes naturelles, des chercheurs de l’Institut de neurosciences Wu Tsai de Stanford ont démontré une amélioration substantielle de la résolution de la transcriptomique spatiale grâce à une astuce astucieuse. En élargissant le tissu cérébral de manière à ce qu’il augmente de 2,5 fois, Bo Wang, professeur adjoint de bio-ingénierie, et ses collègues ont réussi à résoudre les types de neurones de l’hippocampe et du bulbe olfactif du cerveau de la souris de manière beaucoup plus détaillée que ne le permettent les méthodes standard.

Wang est membre de la Neuro-omics Initiative – une initiative Big Ideas in Neuroscience – qui cherche à créer de nouveaux outils pour améliorer notre compréhension du cerveau au niveau moléculaire des gènes et des protéines, et, à terme, combler l’écart entre notre compréhension du des molécules microscopiques jusqu’aux circuits et réseaux cérébraux à grande échelle. La nouvelle technique, appelée transcriptomique spatiale d’expansion (Ex-ST en abrégé), est un excellent exemple d’un nouvel outil qui propulsera l’Initiative Neuro-omique vers l’avant dans cette mission.

Une vue élargie

La transcriptomique spatiale repose sur la capture d’instructions génétiques appelées ARNm à partir de coupes de tissus. Ces instructions d’ARNm guident nos cellules dans la fabrication de leur machinerie protéique, et leur capture permet aux chercheurs de classer chaque cellule dans un échantillon de tissu plus grand. Le problème était que les matrices de capture standard n’étaient pas suffisamment denses pour capturer l’ARNm de minuscules cellules individuelles. Au lieu de cela, chaque « tache » sur le réseau capture l’ARNm de types de cellules qui se chevauchent, ce qui rend difficile l’identification de cellules individuelles.

Pour contourner le problème, Wang et ses collègues ont adopté une approche quelque peu contre-intuitive. Plutôt que de poursuivre le voyage de plusieurs décennies que les neuroscientifiques ont entrepris pour améliorer la résolution des outils d’imagerie, ils se sont inspirés de la technique de microscopie à expansion mise au point par le laboratoire d’Ed Boyden au MIT. La méthode de Boyden élargit le tissu cérébral lui-même afin qu’il puisse être visualisé à une résolution plus élevée au microscope.

L’équipe de Wang a décidé de voir si la transcriptomique spatiale pouvait bénéficier de la même astuce astucieuse d’expansion des tissus. Plus précisément, ils ont estimé que s’ils pouvaient étendre les cellules, chaque point pourrait alors capturer l’ARNm d’un moins grand nombre de cellules, permettant ainsi une plus grande résolution pour identifier différents neurones.

Pour réaliser cette expansion, l’équipe de recherche, qui comprenait une collaboration avec des scientifiques du laboratoire Science for Life à Stockholm, en Suède, a développé un pipeline qui commence par l’ancrage de l’ARNm à une matrice de gel. Ensuite, ils appliquent des enzymes qui détruisent toutes les protéines du tissu qui ne sont pas extensibles jusqu’à ce qu’il ne reste plus que de l’ARNm en suspension dans un gel, ce que Wang appelle un « tissu fantôme ».

Ici, l’équipe a bénéficié d’un autre ensemble de techniques de microscopie développées par le professeur Karl Deisseroth de Stanford. En ancrant les tissus à un gel puis en éliminant les molécules qui diffusent la lumière, ces techniques de « clarté » rendent les tissus cérébraux presque aussi clairs que du verre.

Le « tissu fantôme » du gel se dilate rapidement lorsqu’il est placé dans l’eau (grâce aux effets de répulsion électrostatique). Au total, il a gonflé d’environ 2,5 fois dans les trois dimensions.

Mais cette croissance impressionnante a également entraîné une perte d’ARNm, laissant des quantités minimes à capturer. Il s’agissait d’un projet incroyablement ambitieux, avec deux équipes travaillant à travers le monde pendant une pandémie.

“Pendant un moment, j’ai pensé que ça ne marcherait jamais. C’est comme si nous étions dans une impasse”, a déclaré Wang. Mais Wang rend hommage aux deux étudiants diplômés qui ont dirigé le projet – Yuhang Fan dans son laboratoire et Žaneta Andrusivová en Suède – pour avoir persévéré et finalement trouvé les ajustements qui ont permis à la méthode de fonctionner. “Ce que je trouve étonnant, c’est qu’ils n’ont pas été découragés par tous ces échecs”, a-t-il déclaré.

En fin de compte, ce voyage ardu a porté ses fruits. Les chercheurs ont pu valider que l’Ex-ST est plus efficace pour résoudre les types de neurones de l’hippocampe et du bulbe olfactif. Par exemple, en examinant les neurones de la région CA1 de l’hippocampe, cruciale pour l’apprentissage et la mémoire, la résolution accrue leur a permis de distinguer l’ARNm présent dans les dendrites très longues et en forme d’antenne des cellules par rapport aux corps cellulaires plus compacts. Ainsi, Ex-ST offre une nouvelle fenêtre sur l’activité des gènes qui se produit à différents endroits au sein des neurones individuels.

Wang espère que leur nouvelle méthode Ex-ST aura un impact immédiat sur les milliers de neuroscientifiques du monde entier qui utilisent déjà ces méthodes. “Ils pourraient bénéficier de notre méthode car il ne s’agit que d’une petite modification de leurs protocoles, ils peuvent donc littéralement répéter leurs expériences et améliorer considérablement leurs résultats”, a déclaré Wang.

L’avenir de la méthode Ex-ST

Lorsque Liqun Luo, professeur de biologie et co-auteur de l’article, a vu pour la première fois le succès de la méthode Ex-ST, il a été enthousiasmé par le fait qu’une idée aussi simple mais intelligente se soit révélée si efficace. “Il combine deux technologies de pointe, la microscopie à expansion et la transcriptomique spatiale, pour permettre le profilage de l’expression des gènes dans les tissus cérébraux avec une résolution étonnante, jusqu’à celle d’une seule cellule”, a-t-il déclaré.

Luo est également l’un des principaux chercheurs de l’Initiative Neuro-omics et note qu’il est ravi de pouvoir désormais intégrer la méthode Ex-ST. “Un élément majeur de la neuro-omique consiste à appliquer des technologies transcriptomiques unicellulaires de pointe pour résoudre les types de cellules neuronales”, a déclaré Luo. “Désormais, Ex-ST permet une telle analyse avec une résolution bien améliorée, ce qui constitue une base importante pour comprendre la structure et la fonction du tissu cérébral.”

Même avec de vastes améliorations, l’équipe de recherche vise toujours à augmenter encore la résolution. Actuellement, ils progressent vers le développement d’une méthode capable de déchiffrer des sous-types spécifiques d’ARNm, comme ceux présentant certaines modifications. C’est une tâche qui n’est rendue possible que grâce à leurs travaux pionniers visant à accroître l’efficacité de la transcriptomique spatiale.

Conformément aux objectifs de l’Initiative Neuro-omique, l’équipe de Wang se dirige dans cette direction car elle en révélera davantage sur le fonctionnement des plus petites parties du cerveau. Ils n’utilisent pas seulement des modèles d’ARNm pour distinguer différents types de cellules : ils veulent également savoir ce que ces différents messages génétiques signifient pour le fonctionnement cellulaire. “C’est là que nous allons parce que nous pensons que cela peut nous donner plus d’informations sur ce que font réellement les cellules cérébrales.”